Dans ce rayon, s’effectue la préparation des milieux de cultures (gélose au sang, BCP, BGA,
CHAPMAN, Mac Conkey, Mueller Hinton.etc.).
LES MILIEUX DE CULTURES
Le bactériologiste utilise des milieux de culture pour isoler les bactéries du milieu qui les contient, les
identifier, étudier leurs propriétés et, éventuellement les conserver.
Les milieux de culture utilisés peuvent être obtenus de différentes façons. Ils peuvent être:
– Achetés, conditionnés, prêts à l’emploi. Cette solution même si elle est onéreuse est valable que
pour les laboratoires ayant une consommation limitée et régulière de milieux d’usage courant. Elle
s’impose le plus souvent pour certains milieux dont la préparation est délicate et complexe.
– Préparés à partir des différents ingrédients entrant dans leur formule. La formule d’un milieu
ressemble un peu à une recette de cuisine, chaque détail de son exécution doit être respecté.
– Préparés à partir de milieux secs déshydratés. Cette technique permet de concilier une préparation
simple, rapide, pratiquement sans risque d’erreurs et un prix de revient relativement bas.
– Préparés, juste au moment de l’utilisation sous leur forme définitive. Certains milieux exigent, juste
avant leur emploi, l’addition de substances périssables, d’autres, un conditionnement n’autorisant qu’un
court délai de conservation, etc.
– Préparation classique d’un milieu
Avant d’entreprendre la préparation d’un milieu, le technicien se fera un devoir de se renseigner
sur l’utilisation à laquelle il est destiné. Il est d’ailleurs souhaitable de pouvoir lui présenter un tube ou
un flacon témoin provenant d’une précédente fabrication et l’aspect (ou les différents aspects) du
milieu après un développement bactérien.
a) Lecture et interprétation de la formule de préparation
Rassembler les différents constituants.
Vérifier qu’aucun oubli n’a été commis et que la nature et la qualité des produits ont bien été
respectées.
b) Pesée des différents constituants
On pèse le plus souvent à 0,1 g près sauf pour certains corps chimiques qui entrent en très
faible quantité dans la composition de milieux spéciaux et pour lesquels une précision de
l’ordre de 0,0001 g peut être exigée.
c) Dissolution
Suivant la quantité de milieu à préparer, prendre un grand bécher
Mesurer la quantité d’eau nécessaire et, si la dissolution doit se faire à chaud, la porter à la
température désirée.
Ajouter les ingrédients dans l’ordre indiqué.
Agiter jusqu’à dissolution complète des constituants.
d) Ajustement Du PH
Un milieu de culture est le plus souvent neutre ou très légèrement basique, exceptionnellement il
peut être franchement alcalin ou acide. De toute façon, il est essentiel que la mesure de cette acidité,
neutralité ou alcalinité soit effectuée correctement. Cette mesure correspond à la concentration en
ions hydrogène du milieu autrement dit au pH. L’échelle des valeurs du pH s’étend de 1 (mesure
extrême de l’acidité) à 14 (mesure extrême de l’alcalinité).
En bactériologie, on peut se contenter d’une évaluation approximative de la mesure du PH par
colorimétrie :
On ajoute au milieu une substance colorée dite « indicateur de pH » ; ces substances ont la
propriété de changer de teinte pour une certaine valeur du pH appelée : zone de virage.
Les indicateurs de pH les plus utilisés en biologie sont ceux dont la zone de virage se situe
aux environs de la neutralité :
– Le bleu de bromothymol qui vire du jaune (acidité pH 6) au vert (neutralité) puis au bleu
(alcalinité pH 7,8).
– Le rouge de phénol qui vire du jaune (acidité) à l’orangé (neutralité pH 7) puis au rouge
carmin (alcalinité pH 8).
Si le pH est inférieur au pH désiré (donc trop acide), on ajoute quelques gouttes de soude
diluées (environ au 1/100), on mélange, on vérifie le nouveau pH, on recommence l’opération
si nécessaire;
Si le pH est supérieur au pH désiré (donc trop alcalin), on ajoute quelques gouttes d’acide
chlorhydrique dilué (environ au 1/20), on mélange, on vérifie.
e) Filtration
La filtration du milieu préparé n’est pas systématique, elle ne sera envisagée que si le milieu
est trouble. Elle est effectuée sur de grands filtres plissés en papier à gros grains ou sur filtre
millipore.
Beaucoup de milieux se solidifient en refroidissant (milieux gélosés), leur filtration doit être
effectuée dans des entonnoirs chauffants, ou dans une cuve de l’autoclave non fermé par
exemple.
On peut effectuer la filtration avant l’ajout de l’agar-agar et avant l’autoclavage, ce qui évite
l’utilisation de matériel chauffant.
f) Répartition
Les milieux sont les plus souvent répartis avant leur stérilisation, cette répartition est effectuée,
suivant l’équipement du laboratoire, à l’aide:
– D’un grand entonnoir en verre dont la tige est prolongée par un tuyau de caoutchouc terminé par
un embout de verre. Une pince spéciale, dite pince de Mohr, placée au niveau du tuyau permet de régler
le débit.
– D’un répartiteur automatique, sorte de pompe aspirante et refoulante qui, après réglage préalable,
distribue à un rythme régulier le volume désiré.
g) Stérilisation
La stérilisation est effectuée le plus souvent à l’autoclave à 115 – 120 °C pendant 20min.
h) Après la stérilisation
Certains milieux gélosés doivent être mis à refroidir en position inclinée de façon à obtenir une
pente après solidification.
Poser dans ce cas le haut du tube encore chaud sur une longue baguette de verre de gros
diamètre en veillant à ce que le milieu gélosé n’arrive pas à plus de 2 à 3 cm du bouchon.
Les tubes de milieux de culture sont stockés en position verticale dans un endroit frais et
obscur.
· Voici quelques milieux de cultures utilisés le plus souvent dans le laboratoire de bactériologie du
C.H.U. de SBA :
GELOSE CHAPMAN
Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout utilisé
en microbiologie médicale, permettant la croissance des germes
halophiles. Parmi ces germes figurent au premier rang les
bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus,
les Enterococcus, les Bacillus, et de rares bactéries à Gram
négatif.
La composition d’un milieu Chapman, en grammes par litre d’eau distillée, est la suivante :
Rouge de phénol
– Principe du milieu Chapman
Ce milieu contient un inhibiteur : fortes concentrations en chlorure de sodium (75 g.L-1), ce qui permet
un isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en NaCl.
On peut étudier la fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur coloré, le rouge de
phénol, autour des colonies.
– Technique
L’ensemencement doit être massif, en stries serrées ou par inondation.
Ne pas sécher le milieu à l’étuve avant l’ensemencement : la dessiccation du milieu pourrait entraîner une
augmentation de la concentration en NaCl et rendre le milieu trop inhibiteur.
– Lecture
L’utilisation du mannitol se traduira par une acidification du
milieu, provoquant le virage au jaune de l’indicateur de pH. (Les
colonies staph+ sont entourées d’une auréole jaune).
L’utilisation du mannitol est un caractère discriminatif important dans le genre staphylococcus,
staphylococcus aureus étant mannitol+.
Ne pas confondre entre la pigmentation des colonies et le virage de l’indicateur coloré, ainsi des
colonies pigmentées en jaunes et mannitol+ : forte suspicion de staph aureus.
NB : Le milieu Chapman permet la sélection des staphylococcus et une orientation pour l’identification
de l’espèce S. aureus. Mais il s’agit que d’un test de présomption et une confirmation par des tests plus
spécifiques (Coagulase, ADNase…) reste obligatoire.
MILIEU MAC CONKEY
Milieu sélectif pour l’isolement des bacilles Gram- Salmonella et
Shigella ainsi que des bactéries coliformes dans les eaux, les produits
alimentaires, les produits pharmaceutiques et biologiques.
La composition d’un milieu Mac Conkey en g/L d’eau distillée avec un PH=7.1, est la suivante :
Rouge neutre
– Principe du milieu Mac Conkey
Ce milieu contient deux inhibiteurs de la flore Gram+, les sels biliaires et le cristal violet et un critère de
différenciation, le lactose dont l’utilisation est révélé par l’indicateur coloré du milieu, le rouge neutre. Il vire
au rouge en milieu acide.
Si la bactérie ensemencée fermente le lactose, le milieu devient rouge, par virage du rouge neutre, du
fait de l’acidification du milieu.
– Ensemencement
L’isolement se fait par la méthode des cadrans.
Incuber 18 à 24 h à 37 °C.
– Lecture
Les Colonies rouges entourées d’un hâlo opaque de la même couleur du à la précipitation des sels
biliaires: Lactose+ , et les Colonies jaunes ou incolores : Lactose-
GELOSE SS
La gélose SS est la gélose Salmonella-Shigella qui est le milieu sélectif permettant l’isolement
d’entérobactéries pathogènes. Il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles et les denrées
alimentaires peu pour les Shigella car trop sélectif.
C’est un milieu utilisé pour la détection et l’isolement des entérobacteriacées dans l’eau, les produits
alimentaires, l’urine et les selles
Ce milieu facilite la différenciation des colonies par le caractère lactose. Il inhibe l’envahissement de la
surface de la boite par des nappes de Proteus car il ne contient pas d’électrolytes. C’est un milieu non
sélectif qui est utilisé pour l’isolement de nombreuses espèces n’appartenant pas aux entérobactéries.
C’est un milieu contenant une base nutritive ordinaire permettant la pousser des bactéries non exigeantes.
Il contient un critère de différenciation : la fermentation du lactose révélée par le virage en milieu acide de
l’indicateur coloré de pH, le bromocrésol pourpre.
C’est un milieu d’isolement enrichi sur lequel les Streptocoques se développent bien. Il permet, la
lecture du caractère hémolytique. C’est un milieu riche d’autant plus par la présence de sang.
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