Dans un premier temps, suite à la mise au point des différentes conditions d’extraction des tanins, nous avons procédé à la séparation des tanins à partir des marcs de raisin puis dans un second temps nous avons caractérisé les tanins par différentes techniques expérimentales telles que la spectrométrie ultra violet (UV), la résonance magnétique nucléaire du carbone 13, le dosage des sucres par (HPAEC-PAD), et enfin l’analyse des tanins par Chromatographie d’Exclusion Stérique.
2.1 Matière première
Trois types de marcs on été utilisés :
Des marcs de raisins provenant de la vendange de l’année 2011, fournis par la distillerie vinicole du Blayais, située dans le Bordelais en Gironde. Issus du vin rouge, les marcs sont frais, non broyés, avec une humidité d’environ 70 %, composés d’un mélange de cépages.
Les marcs de raisins provenant de la vendange de l’année 2011 également, fournis par la distillerie vinicole « UDM – Union de la Distillerie de la Méditerranée», située à Vauvert dans le département du Gard. Issus du vin rouge, les marcs sont secs et broyés, avec une humidité d’environ 10 %.
Et enfin, les marcs de raisins provenant de la vendange de l’année 2010, fournis par la distillerie Jean Goyard, située à Ay dans le département de la Marne. Issus du vin blanc, les marcs sont secs et broyés, avec une humidité d’environ 8 %.
2.2 Extraction des Tanins
On a utilisé dans cette partie d’étude, des marcs de raisins fournis par la distillerie Blayais (figure 4). L’étude a été menée sur un seul type de marc pour éviter les variations dues aux différences d’humidité, de masse sèche, et de caractéristiques de biomasse.
Figure 4 : Marcs de raisin frais et après lyophilisation.
La figure 5 montre le procédé d’extraction des tanins étudiés : on a utilisé de l’hydroxyde de sodium (NaOH), du sulfite de sodium (Na2SO3), du bisulfite de sodium (NaHSO3), et du carbonate de sodium (Na2CO3) comme réactifs, selon les conditions données dans le tableau 2. Pour certains essais de l’urée a été ajoutée (voir tableau 2).
Figure 5 : Schéma du procédé d’extraction des tanins de marc de raisin
Dans un ballon de 2 L, on introduit 150 g de marc de raisin, puis une solution aqueuse contenant les réactifs d’extraction dont le volume d’eau est égal à 6 fois le volume de marc utilisé calculé sur la masse sèche; la solution est mise dans un bain marie chauffé à 80 °C avec agitation pendant 4 heures.
On procède ensuite à la séparation et la filtration qui se fait à l’aide d’un Büchner sous vide. On a utilisé un entonnoir de Büchner avec une rondelle de papier filtre et une fiole à vide reliée à une source de vide. On obtient alors un filtrat liquide noir rougeâtre et un résidu solide.
La fraction liquide récupérée est ensuite concentrée à l’aide d’un évaporateur rotatif à une température de 60 °C.
Deux procédés ont été adoptés pour le conditionnement du filtrat :
– 1°/ la fraction liquide a été congelée à l’azote liquide et lyophilisée (l’eau est sublimée à basse température et très basse pression) à l’aide du lyophilisateur présenté sur la figure 6; une poudre de tanins a donc été obtenue, plus facile à utiliser pour les analyses et conservable sans variation des propriétés.
Le rendement de l’extraction a été calculé avec la formule :
Rendement = (masse lyophilisée / masse de marc sec) * 100
Figure 6 : Lyophilisateur.
– 2°/ Concentration à 30 % de la fraction liquide au niveau de l’évaporateur rotatif. L’avantage de cette technique est le gain de temps permettant de faire les analyses de temps de gel et l’analyse des tanins par SEC en phase aqueuse sans rajout d’eau.
Rendement = (Masse sèche*Masse totale/Masse de marc initial) * 100
2.3 Lignine de Klason
0,175 g de matière à analyser (calculée sur masse sèche) a été traitée avec 1,5 mL d’acide sulfurique à 72 % pendant une heure dans un bain à 30 °C afin d’hydrolyser totalement les polysaccharides. Le mélange a ensuite été dilué jusqu’à une concentration en acide de 3 % (par ajout d’eau distillée) afin de précipiter les composés insolubles (polyphénols). Cette réaction a eu lieu dans un autoclave porté à 121 °C et 1,5 bar pendant une heure.
Les échantillons ont été refroidis à l’aide d’eau fraîche puis filtrés. Une fraction solide et une fraction liquide ont alors été obtenues :
La fraction solide donne le taux de lignine de Klason, calculé en pourcentage de matière sèche. Pour cela, la fraction solide est pesée après une nuit passée à l’étuve à 105 °C. Cette fraction contient les composés qui ne sont pas dissous avec une attaque acide (comme les tanins). Il n’est pas judicieux d’utiliser cette méthode pour déterminer le taux de tanins de nos échantillons, d’autres composés phénoliques ou non phénoliques (protéines, inorganiques) pouvant être présents.
La fraction liquide contient les sucres hydrolysés sous forme de monomères. Elle renseigne donc le taux de polysaccharides (cellulose, hémicelluloses et pectines) contenu dans la matière via analyse de ces monomères par chromatographie ionique (figure 7).
Figure 7 : Chromatographe ionique.
2.4 Temps de gel
Le temps de gel est défini comme l’intervalle de temps entre l’introduction du catalyseur dans un adhésif liquide et la formation d’un gel. La solution de base de l’adhésif (une solution aqueuse à 30 % de tanin en masse) a été placée dans un tube à essai. Après ajout de 5 % de paraformaldéhyde par rapport à la masse de tanin, ce tube a été maintenu dans un bain d’eau à une température de 100 °C et le mélange a été agité de manière régulière à l’aide d’un fil torsadé (figure 8). Le temps de gel représente le temps nécessaire pour coller à compter du moment où l’ensemble a été placé dans le bain.
Cette analyse se fait à pH donné, celui-ci peut être ajusté afin d’optimiser le temps de gel. Il est ajusté à l’aide d’hydroxyde de sodium (NaOH) à 33 % et d’acide chlorhydrique (HCl) à 4M.
Figure 8 : Fil utilisé pour la mesure du temps de gel.
Pour chaque série, deux essais ont été effectués. Le but de l’étude était d’obtenir un temps de gel de moins de 300 secondes.
2.5 Spectrophotométrie Ultraviolet (UV)
Une courbe standard a été préparée à partir d’une série de solutions de tanin de marc de raisin de concentrations connues à l’aide d’un Varian 2550 UV-vis de numérisation spectrophotomètre (Figure 9). Cette méthode a été étendue afin de déterminer la teneur en matière polyphénolique des tanins extraits obéissant à la loi de Beer-Lambert. Dans une cuve en quartz de 1 cm de largueur, on introduit environ 1 ml de la solution de tanin à analyser (0,5 mg d’extrait de tanin brute dilué dans 10 ml d’eau distillée), après quelques minutes l’absorbance est lue à une longueur d’onde à 280 nm au spectrophotomètre UV-visible 2550.
Figure 9 : Courbe étalon avec la catéchine hydrate
2.6 Dosage des Sucres par : HPAEC-PAD analyses
Les sucres sont dosés et identifiés par HPAEC-PAD. Les analyses sont effectuées sur une chaîne chromatographique du type DIONEX ICS-3000 équipée de colonne Carboparc PA20 DIONEX. (3×150 mm) avec une colonne de garde (3x50mm) comme phase stationnaire permettant de séparer et d’identifier les sucres selon leurs tailles. La phase mobile est préparée par dilution d’une solution NaOH 46-48 % dans l’eau ultra-pure.
Monosaccharides et acides uroniques sont séparés respectivement en utilisant des conditions isocratiques et un gradient d’élution linéaire.
Tous les éluants ont été dégazés avant utilisation à l’hélium pendant 20 minutes, ils ont ensuite été maintenus sous une pression constante d’hélium (éluant module de dégazage, DIONEX). La colonne a été lavée avant le dosage pendant 10 min avec 250 mM de NaOH dans le but de rééquilibrer le système de dosage.
Les échantillons ont été injectés dans une boucle complète de 25 μL et les séparations ont été effectuées à 35 °C à une vitesse de 0.4 mL/min. La séquence d’impulsions pour la détection ampérométrique pulsée est composée d’un potentiel de +100 mV (0-200ms), +100 mV (200-400 ms), -2000mV (410-420 ms), + 600 mV (430ms), et -100mV (440 -500ms).
Les étalons sont le rhamnose, le galactose, l’arabinose, le glucose, le mannose, le xylose, l’acide galacturonique et l’acide glucuronique.
2.7 Spectre 13C-RMN
Méthode utile pour déterminer la structure des composés, la spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (figure 10) permet de préciser la formule développée, la stéréochimie et dans certains cas la conformation du composé étudié (Navarrete Fuentes, 2011).
La RMN tire des informations de l’interaction qui naît entre les noyaux des atomes et certains éléments présents dans l’échantillon étudié et le champ magnétique intense et constant, produit par un aimant, auquel on le soumet. Le document de base fourni par tous les appareils est le spectre RMN.
Le spectre RMN correspond à l’absorption par certains atomes de l’échantillon, de certaines des fréquences présentes dans la source électromagnétique. L’interprétation de ces signaux (position, aspect, intensité) conduit à un ensemble d’informations d’où l’on déduit des détails de structure concernant l’échantillon. Ces essais peuvent être effectués en phase liquide ou solide (Navarrete Fuentes, 2011).
Les spectres de RMN ont été réalisés sur un appareil Bruker 300 à une fréquence de 300 MHz au service commun de RMN à l’Université de Nancy 1. Environ 1 (g) de tanins sont versés dans un tube à essais additionnées de 0,5 ml de l’eau lourde, Deutérium oxyde (D2O). On a utilisé un échantillon de tanin issu de marcs de Blayais pour les analyses.
Figure 10 : Appareil (A) et Schéma de RMN (B). (Navarrete Fuentes, 2011).
2.8 Analyse des Tanins par Chromatographie d’Exclusion Stérique après l’acétylation en solvant organique (THF)
Les échantillons de tanins lyophilisés ont été acétylés (5-10 mg) dans un mélange pyridine – l’anhydride acétique (1:1, 2 ml) pendant une nuit à température ambiante. Le précipité obtenu en versant ce mélange dans de l’eau distillée a été récupéré par filtration sous vide ou, pour les échantillons pour lesquels aucun précipité n’était visible, par trois extractions successives avec du diéthyle éther suivies d’une filtration.
L’analyse, en utilisant un solvant organique (THF) comme phase mobile a été envisagée après l’acétylation, (2-5 mg/mL) ont été ajoutés à chaque échantillon pour les analyser par Chromatographie d’Exclusion Stérique de type (UltiMate 3000, Dionex) qui contient différents modules :
Une pompe isocratique qui assure le débit et la pression. Des passeurs d’échantillons qui garantissent des injections fiables, précises et exactes, les échantillons sont dissous dans 20mg/ml de solvant et le débit a été fixé à 1ml/min). Un four à colonne formé d’une colonne de garde et deux colonnes P4000 et P3000 (Polysep-GFC-P). Pendant l’analyse la température du four à colonne était fixé à 40 °C. Et enfin, des détecteurs qui sont disponibles pour la détection d’une large gamme de composés, en UV 280_nm; et en indice de réfraction (IOTA2).
Pour l’exploitation des données, le logiciel Chromeleon version 6.8 (Dionex corp, USA) a été utilisé, une courbe d’étalon à été réalisée avec 1,5 ml de THF ajouté à 4 à 5 mg de polystyrène. Le mélange a ensuite été soumis à ultra sons pendant 5 min à 4000 RPM, à partir de 5 poids moléculaires différents de : PS162, PS820, PS1920, PS3700, PS8620.
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