3-Résultats et discussion
3-1 Résultats
3-1-1 Test sérologique
Les différentes prospections effectuées dans le cadre de notre étude ont permis de collecter 52 échantillons dont les symptômes s’apparentent à ceux du RYMV , qui se répartissent comme suit :
10 échantillons à Dangbo (Tovè)
16 échantillons à kpinnou ( Lokossa)
Et 26 échantillons à kinwèdji (Lokossa)
Le diagnostic sérologique par test ACP ELISA de 52 échantillons collectés a révélé la positivité de 15 échantillons, donc hébergeant le virus. Outre le riz, certaines espèces de plantes ont présenté des symptômes du RYMV ou de chlorose foliaire au cours de nos observations.
Le test de propagation sur (IR64,Giganté ,Tog5681,Tog5672 ,et Tog5674) fait à ces 52 échantillons auxquels sont ajoutés 25 autres échantillons collectés en 2007, a révélé au total 19échantillons ayant induit des symptômes sur IR64. La majorité des échantillons ont induits des symptômes très faibles et bien après 28 JAI, ce qui explique la faible virulence des isolats du RYMV au Sud-Bénin. Peu d’échantillons ayant réagi positivement au test ELISA, ont induit des symptômes à l’indexage sur les variétés choisies.
A cet effet, une seconde série d’inoculations est effectuée à partir d’échantillons ayant induits des symptômes. Au nombre de 19, ces isolats sont inoculés aux cinq variétés de départ (IR 64, Giganté, Tog 5672, Tog 5674, Tog 5681) et ont induits des symptômes plus clairs et visibles et déjà à 7JAI, ce qui explique le simple fait que l’infectiosité du virus augmente (deviennent plus virulents) au cours des séries d’inoculations. Au cours de cette seconde série d’inoculations, 3 isolats ont induit des symptômes sur la variété résistante Tog 5674 comportant l’allèle rymv1-5, et donc appartiennent donc au groupe des isolats capables de contourner la résistance des variétés.
Les isolats ayant réagi positifs au test ELISA, et n’ayant pas induits des symptômes lors de la 1ère propagation ont été à nouveau inoculés aux variétés IR64 et Bouaké 189. Certains parmi eux ont induit des symptômes sur les deux variétés, d’autres n’en ont pas induit, ceci prouve une fois encore la faible virulence des isolats du RYMV au Sud-Bénin.
Ces différentes propagations nous ont amené à opérer un choix de 21 isolats pour procéder à l’analyse de la diversité sérologique à l’aide de 10 anticorps polyclonaux dont les résultats sont illustrés par la figure 4.
A 100% de coefficient de ressemblance, les isolats I-01 et I-08 sont identiques d’une part, et I-03,I-11, I-18 d’autre part. Les isolats I-13,I-17,I-21,I-13,I-14 sont identiques du point de vue sérologique, de même I-02,I-05 identique d’une part et I-06,I-07,I-10 d’autre part.
A 75% de coefficient de ressemblance, nous obtenons 3 groupes sérologiques, que nous dénommons Sgb1, Sgb2, Sgb3.
• Le premier groupe sérologique Sgb1 comprend les isolats (I-01, I-08, I-03, I-11, I-18, I-04) provenant des localités de Lokossa et de Calavi et des hôtes tels qu’Oryza sp et les mauvaises herbes.
• Le second groupe sérologique Sgb2 regroupe les isolats provenant des 3 localités parcourues Lokossa, Dangbo, Calavi, (I-12, I-19, I-13, I-17, I-21, I-15, I-14, I-16, I-20) et proviennent aussi bien du riz que des mauvaises herbes.
• Le troisième groupe Sgb3 regroupe les isolats (I-02, I-05, I-06, I-07, I-10,) provenant des localités de Lokossa, Calavi, Dangbo et I-09 un isolat du Niger qui a été inséré parmi les isolats utilisés.
Figure 4 : Dendrogramme montrant la diversité sérologique des isolats du Sud-Bénin.
L’étude effectuée à Montpellier par TAS ELISA à l’aide d’anticorps monoclonaux a permis de détecter la présence de 2 sérotypes (souches) :Ser1et Ser2 , typiques de l’Afrique de l’Ouest (Tableau 9).
Tableau 8 : Liste des isolats classés en sérogroupes
Tableau 9 : Liste des isolats et leurs sérotypes.
*** : souche non déterminée
3-1-2 Test pathogénique
3-1-2-1 Sévérité des symptômes foliaires
Les symptômes foliaires se sont exprimés avec des intensités différentes selon les isolats et les variétés. A 7 JAI, après inoculation, les variétés IR64 et Bouaké 189, étaient les premières à manifester les symptômes sur les dernières feuilles dégainées, et pour toutes les techniques d’inoculation. A 14 JAI, après inoculation, seul l’isolat I-09 (provenant du Niger) a induit des symptômes sur la variété Tog 5681, et la variété IR47686-9-2-1 a été attaquée par tous les isolats.
A 21 et 42 jours après inoculation ,les données de la chlorose foliaire et de la hauteur sont recueillies. Les moyennes d’incidence et de sévérité sont calculées.(Annexe4). Les variétés (par isolat) ayant une moyenne d’incidence et de sévérité inférieure à celle de l’isolat sont considérées comme résistantes. Dans le cas contraire, elles sont sensibles.
Les variétés IR64, Bouaké 189 et IR47686-9-2-1 sont les plus sensibles. Les symptômes s’apparaissent sur Tog et Gigante, mais n’atteignent pas un seuil élevé, sauf dans quelques cas.
A 21 JAI, on obtient les résultats ci-après :
Tableau10: Résultats du test de pathogénie à 21jours après inoculation (méthode par point de piqûre)
Tableau 11: Résultats du test de pathogénie à 21 jours après inoculation (méthode par friction manuelle)
Tableau 12: Résultats test de pathogénie à 21 jours après inoculation (méthode au coton)
Tableau 13 : Résultats test de pathogénie à 42 jours après inoculation (méthode par point de piqûre)
Tableau14: Résultats test de pathogénie à 42 jours après inoculation (méthode par friction manuelle)
Tableau 15: Résultats test de pathogénie à 42 jours après inoculation (méthode au coton)
3-1-2-2 Hauteur des plantes à 42 jours après inoculation
L’impact de la maladie sur la hauteur des plants a été déterminé à 42JAI. La maladie a
provoqué une réduction de la hauteur des plants, en occurrence sur les variétés IR64 et Bouaké 189 pour toutes les méthodes d’inoculation. Selon la méthode, les interactions variétés/isolats diffèrent.
Figure 5: Effet de l’interaction génotypes (variétés) x environnement (isolats) sur la hauteur des variétés, selon le modèle AMMI technique d’inoculation au coton
Figure 6 : Effet de l’interaction génotypes (variétés) x environnement (isolats) sur la hauteur des variétés, selon le modèle AMMI technique d’inoculation par friction manuelle
Figure 7 : Effet de l’interaction génotypes (variétés ) x environnement (isolats) sur la hauteur des variétés, selon le modèle AMMI technique d’inoculation par points de piqûre
3-1-2-3 Etude des interactions génotypes x isolats en utilisant le modèle AMMI
Le dendrogramme construit ci-dessous (figure 8) montre le niveau de pathogénicité des isolats. Pour la technique par point de piqûre, 4groupes d’isolats ont été caractérisés à un coefficient de 25%, : un 1er groupe constitué des isolats I01, I02, I03,I04, ayant même degré de pathogénicité, un second de l’isolat I09 , le 3ème groupe constitué des isolats I05, I07, I10, I08, ayant même degré de pathogénicité et un 4ème groupe de l’isolat I02.
Pour la technique par frottement manuel, à l’exception de I02, qui constitue un groupe à part, tous les autres isolats constituent un même groupe et sont semblables du point de vue pathogénique.
Trois groupes sont identifiés à un coefficient de 25% de ressemblance, le 1er constitué des isolats I01, I02, I03, I10, I09, I08, I05, I06, un second de l’isolat I07, et un 3ème constitué de I04.
Quelque soit la technique ou méthode d’inoculation, les variétés IR64, Bouaké189, et IR47686-9-2-1 sont les plus attaquées, le niveau de résistance des variétés Tog5681, et Gigante varie selon les techniques. (figure9)
Figure 8 : Dendrogramme montrant les différents pathotypes par technique d’inoculation en utilisant le modèle AMMI (additive main effects and multiplicate interaction
Pin méthod : méthode d’inoculation par points de piqure
Finger method : méthode d’inoculation par friction manuelle
Cotton method : méthode d’inoculation au coton
Figure 9 : Dendrogramme montrant le niveau de résistance des variétés en utilisant le modèle AMMI (additive main effects and multiplicate interaction)
Figure 10: Symptômes de chlorose foliaire et de rabougrissement sur la variété IR64
A : plant attaqué présentant les symptômes de chlorose et de rabougrissement
B : plant sain
3-2- Discussion
3-2-1- Sérologie
L’étude de la diversité sérologique du RYMV en Afrique de l’Ouest est un élément utile à la compréhension de l’épidémiologie de cette maladie virale. La diversité du RYMV a été bien étudiée au niveau immunologique (Mansour et Baillis, 1994 ; Konaté et al., 1997) et moléculaire (Mansour et Baillis, 1994 ; Konaté et al.,1997 ; N’Guessan et al., 2000 ; Fargette et al.,2002a) en Afrique de l’Ouest. Au Bénin, la diversité sérologique a été étudiée, mais en prenant en compte les isolats du Nord-Bénin. Cependant, certaines régions du Sud –Bénin n’ont pas été explorées ou l’ont été insuffisamment. C’est pourquoi, il a été procédé à une prospection et collecte d’échantillons du RYMV dans les localités de Lokossa, Dangbo et Calavi (Station de Africa Rice Center), afin d’étudier aussi la diversité sérologique au Sud-Bénin. Très répandu dans toutes les régions du continent africain où le riz est cultivé (Abo et al.,1998) , le RYMV a été décrit comme un virus variable avec de nombreuses variantes pathologiques (Thottapilly et Rossel ,1993 ; Sasaya et al.,1997, Konaté et al.,1997, N’Guessan et al .,2000) et le nombre illimité de caractères pathologiques et morphologiques du RYMV, les erreurs de standardisation et des conditions pathologiques , des tests de virulence de différents chercheurs ont conduit à la confusion et l’incertitude dans la caractérisation de cet agent pathogène du riz (Taylor et al ., 1990, Mansour et Baillis ,1994).
La classification des isolats du RYMV provenant des localités de Lokossa, Dangbo, Calavi, du Sud-Bénin a été répartie en trois groupes sérologiques Sgb1, Sgb2, Sgb3. Ces résultats indiquent que des isolats provenant de la même localité ; du même hôte, voire même aire de répartition (champ) sont différents du point de vue sérologique (I-01, et I-02), ce qui explique le fait que de nombreuses interactions existent dans un ensemble d’isolats de souches apparentées dans nos localités du Sud-Bénin. Cette possibilité d’interaction entre isolats du même hôte varie ainsi d’une localité à l’autre, compte tenu de la variabilité (diversité) sérologique existant entre différents isolats du RYMV au Bénin. De même, des similitudes sérologiques ont été observées entre isolats de différentes localités (I-12, I-19, I-14) confirmant ainsi le potentiel de l’infection au RYMV, transmise en conditions naturelles par des insectes vecteurs (Bakker , 1971, Hammond et al ., 1999).
Les travaux initiaux de Fauquet et Thouvenel (1997) ont mis en évidence, une distinction sérologique entre deux isolats de Côte d’Ivoire, et du Nigéria et un isolat du Kenya. Par la suite, des isolats originaires de la Côte d’Ivoire, de la Sierra Léone, du Niger et du Nigéria, ont été classés en plusieurs sérogroupes différents (Mansour et Baillis, 1994). De même, à partir d’isolats provenant du Burkina-Faso, et du Mali, trois sérogroupes RYMV-I, RYMV-II, et RYMV-III, ont été mis en évidence basés sur leurs réactions avec des anticorps polyclonaux. La distribution géographique est différente, mais partiellement chevauchante (Konaté et al .,1997). Plus récemment, la diversité des isolats du RYMV a été appréhendée, à l’aide d’approches complémentaires et sérologiques, biologiques et moléculaires. Les méthodes sérologiques ont révélé plusieurs sérotypes différenciés d’après leurs réactions avec des anticorps monoclonaux et polyclonaux. Trois anticorps polyclonaux (RYMV-CI, RYMV-M, RYMV-Mg,) et huit anticorps monoclonaux ont été ainsi utilisés pour tester 125 isolats différents. Ce travail a montré l’existence de deux sérogroupes majeurs en Côte d’Ivoire : Ser1, au Nord du pays (souche de savane) et Ser2, au Centre et au Sud du pays (souche de forêt). D’autres profils immunologiques ont été détectés dans d’autre pays d’Afrique de l’Ouest, l’Afrique de l’Est et à Madagascar.( N’guessan et al.,2000).
Au Bénin, les résultats obtenus par Bancolé (2006) ont révélé une forte diversité sérologique au Nord du Bénin. Trois groupes sérologiques ont été identifiés avec les isolats utilisés. Bsg-1et Bsg-2 constitués d’isolats provenant des localités de Djougou, Malanville, Tanguiéta retrouvés aussi bien sur le riz que sur les hôtes alternatifs. Par ailleurs, nos résultats n’indiquent pas l’appartenance d’isolats d’un même groupe sérologique à la même localité, ce qui est en contradiction avec les travaux de Traoré (2006) selon lesquels la distribution géographique des isolats met en évidence une relation possible entre variation écologique et origine écologique des isolats.
La transmission réalisée par des coléoptères selon un mode non spécifique ne semble pas favoriser la transmission d’une souche au détriment d’une autre. La répartition spatiale des souches du RYMV pourrait être due à la distribution géographique des plantes réservoirs (graminées sauvages) du virus. Puisque l’écosystème de l’Afrique de l’Ouest est différent de celui de l’Afrique de l’Est, celui de la forêt différent de celui de la savane, l’adaptation de ces graminées sauvages dans chaque région du continent n’a pas été homogène.
Ainsi la co-évolution hôte-virus dans chaque territoire concerné a été différente, provoquant probablement l’état actuel de répartition des souches du RYMV (Pinel et al, 2000). Par ailleurs dans la présente étude, l’efficacité des 10 anticorps utilisés a conduit à la distinction complète de tous les isolats à un niveau similaire de 95% c’est-à-dire que ces distinctions sérologiques entre isolats suggère qu’ils sont différents dans une combinaison spécifique d’épitopes (N’Guessan et al ., 2000). Cependant, certains isolats du point de vue sérologique étaient similaires à 100% ,c’est le cas de I-01, I-08, de I-02, I-05, de I-06, I-07, I-10, cela peut être dû à la similitude dans l’origine écologique de ces isolats (Konaté et al.,1997). La diversité sérologique observé entre isolats semblables et provenant de différentes écologies confirme l’infection du potentiel viral en conditions naturelles par les insectes vecteurs (Bakker ,1971 ; Hammond et al ., 1999). De telles possibilités d’interactions au sein d’un ensemble d’isolats de souches apparentées, pourraient conduire à l’apparition fréquente de mutants qui pourraient être responsables du niveau élevé de variation sérologique parmi les isolats.
Le présent résultat révèle que l’utilisation des données de l’analyse sérologique par test ACP ELISA, est d’un grand potentiel pour l’identification et la classification des isolats du RYMV au Bénin. La présence du sérotype Ser2 dans les zones écologiques du Sud-Bénin, montre que le virus aurait migré sous l’effet combiné de plusieurs facteurs écologiques. La classification phylogénétique de chaque isolat du RYMV, doit être utile, dans les études épidémiologiques et aussi de connaitre l’identité des isolats, du Sud-Bénin.
3-2-2- Pathogénie
La pathogénie a été étudiée à partir de 10 isolats venant des différents écosystèmes du Sud-Bénin, et de 5 variétés de riz choisies . Les résultats de cette étude, ont permis de classer les isolats selon deux axes : un axe d’agressivité et un axe de virulence, ceci explique le fait que sur un même hôte, certains isolats provoquent des symptômes plus sévères que d’autres. Cependant , il en ressort de nos expériences , deux niveaux de résistance définis arbitrairement :la résistance élevée qui se traduit par une absence de symptômes , que l’on rencontre chez les variétés Gigante et Tog 5681,(Ndjondjop et al.,1999, Ioannidou et al.,2000 ;) et la résistance partielle, qui se traduit par un retard dans l’apparition des symptômes (Ioannidou et al .,2000 , Ndjiondjop et al .,2001) observée chez la variété IR47686-9-2-1. Les variétés IR64 et Bouaké 189, étaient les plus sensibles et de surcroit à tous les isolats RYMV.
L’agressivité est considérée comme la composante du pouvoir pathogène qui exprime l’intensité des symptômes sur une plante donnée (cultivar ou variété) (Astier et al., 2001), et est la caractéristique permettant de différencier les pathotypes. Au niveau du RYMV, l’existence de plusieurs pathotypes est observée dans la nature (Traoré et al., 2006). L’existence d’isolats pathogéniques dans cette étude révèle les différentes interactions entre isolats et génotypes, et les implications lourdes sur la résistance des génotypes et la stabilité du rendement. Cependant la résistance de certains génotypes aux pathogènes se produit au niveau de l’individu et implique la tolérance physiologique ou la capacité d’adaptation à l’environnement. Néanmoins des isolats ont pu surmonter la résistance à Tog 5681 et Gigante. Ces isolats appartiennent au groupe des isolats contournant la résistance décrits par Fargette et al., (2002), ceci pourrait dépendre en partie de la technique d’inoculation. Dans le cas du RYMV, le contournement de la résistance a été obtenu au laboratoire. Un isolat avirulent a été rendu virulent par passage en série sur un cultivar résistant (Fargette et al.,2002b).Un résultat similaire a été obtenu au cours de nos travaux où quelques isolats ont contourné la résistance à Tog 5674 lors d’une seconde série d’inoculations. Cette a montré également que l’infectiosité du RYMV augmente au cours des séries d’inoculations.
Dans cette présente étude, différents modes d’inoculation ont été évalués : L’inoculation par friction manuelle, l’inoculation avec du coton imbibé, et l’inoculation par point de piqûre mimant ainsi l’infection par un insecte vecteur. Le constat fait est que l’inoculation au coton, et l’inoculation par points de piqûre sont celles qui mettent en contact une grande quantité d’inoculum avec la plante et qui induisent des proportions élevées d’infection, or plus la concentration de l’inoculum est élevée, plus l’infection est efficace. En deçà d’un certain seuil de concentration de l’inoculum il n’ya plus d’infection ou alors c’est une infection résiduelle (Sorho et al., 2005). Il a été observé au cours de nos expériences qu’un isolat RB inoculé au cultivar Tog5681, a induit précocement des symptômes selon la méthode d’inoculation au coton, ce qui explique le fait que les symptômes apparaissent à partir d’un certain seuil de charge virale. Le virus envahit une proportion substantielle des tissus de l’hôte à partir d’un point d’entrée. Le nombre de points d’infections primaires dépend des modes de transmission du virus (Sorho et al., 2005). L’utilisation de cultivars résistants semble être le plus économique des moyens pour réduire les dommages causés par le virus. Dans ce contexte, certaines variétés sont présentées comme résistantes à la panachure jaune du riz. C’est le cas de IR47686-9-2-1.Le résultat de l’inoculation de IR47686-9-2-1 avec différents isolats du RYMV a montré qu’il s’agit d’une résistance partielle. Toutes ces informations sont utiles dans les programmes de sélection pour le déploiement des génotypes résistants pour une résistance variétale au Bénin.